ITIH3 Is a Potential Biomarker for Early Detection of Gastric Cancer

direview oleh : Nur Ismiyati

Kanker lambung merupakan penyebab kedua kematian terbanyak yang diakibatkan oleh kanker. Deteksi dini merupakan kunci untuk meningkatkan kesembuhan pasien kanker lambung. Endoskopi adalah salah satu deteksi yang sering dilakukan, namun metode tersebut menyebakan kerusakan jaringan dan membutuhkan biaya yang cukup besar. Oleh karena itu, penemuan biomarker secara molekuler mulai dikembangkan untuk menemukan metode yang tidak invasif dalam mendeteksi adanya kanker. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi protein potensial pada tikus sebagai kandidat protein biomarker dan selanjutnya memvalidasi protein yang terpilih dalam sampel manusia. Model Mouse Xenograft digunakan sebagai analisis alternatif dengan menggunakan sampel klinik. Penelitian ini memanfaatkan metode iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification) untuk pendekatan profil dari tingkat protein dalam plasma dari tikus kontrol dan tikus perlakuan serta dianalisis menggunakan LC-MS/MS. Validasi hasil protein biomarker tersebut dilakukan dengan metode Western Blot dan immunohistokimia.

Metode Penelitian

Xenograft MKN45 pada Nude Mice. Sel MKN45 sejumlah 5 x 106 ditransplantasikan secara subcutan pada nude mice. Tikus dipisahkan berdasarkan ukuran tumor yaitu kelompok low tumor (1-2 mm); mid tumor (7,5 mm); high tumor (15 mm); dan tikus kontrol (diinjeksi PBS). Darah dari masing-masing kelompok dikumpulkan melalui cardiac punture kemudian disentrifugasi pada 1100 g pada 4°C selama 10 menit untuk memisahkan plasma dari sel darah merah.

iTRAQ labeling dengan analisis LC-MS/MS. Sampel protein dari masing-masing kelompok direduksi, alkilasi, digest, dan dilabel menggunakan reaget iTRAQ. Pelabelan sampel 144 untuk kontrol; 115 untuk low tumor; 116 untuk mid tumor; dan 117 untuk high tumor. Replikasi tiga kali pada metode iTRAQ untuk meningkatkan reliability hasil yang diperoleh. Campuran peptida yang telah dilabel kemudian difraksinasi. Hasil fraksinasi dianalisis menggunakan HPLC dan ToF MS (Time-of-Flight Mass Spectrometer). Identifikasi dan kuantifikasi protein dari sampel iTRAQ dilakukan menggunakan ProteinPilot software.

Western Blotting dan Imunohistokimia. Sampel plasma tikus yang digunakan untuk analisis iTRAQ dilakukan imunoblotting menggunakan antibodi ITIH3. Validasi sampel plasma manusia digunakan 167 sampel terdiri dari 83 sampel normal dan 84 sampel kanker lambung. Protein plasma masing-masing sampel di elektroforesis pada 1D-SDS PAGE, gel ditransfer pada membran PVDF dan dilakukan western blott menggunakan antibodi primer ITIH3 1:1000 serta antibodi sekunder 1:15000. Densitometri dari pita yang terbentuk dianalisis da diperkirakan menggunakan Image Scanner software. Imunohistokimia menggunakan antobodi ITIH3 1:500.

Analisis Statistik. Perbedaan tingkat ekspresi protein dari imunoblot sampel pasna normal dan plasma kanker menggunakan analisis 2-sample t test pada signifikansi 5% menggunakan SPSS 16.0

Hasil Penelitian

Hasil iTRAQ labeling dengan analisis LC-MS/MS diperoleh 31 protein yang diekspresikan berbeda pada masing-masing kelompok tikus perlakuan dibandingkan kelompok kontrol. Protein ITIH3 menunjukkan terekspresi tinggi pada kelompok tikus perlakuan, sehingga menjadi salah satu calon biomarker untuk kanker lambung. ITIH3 merupakan family inter-alpha-tripsin inhibitor yang ditemukan pada matriks ekstraseluler termasuk dalam darah.

Hasil densitometri data western blott menunjukkan overekspresi dari ITIH3 pada plasma tikus perlakuan 3,1 kali lipat dibandingkan plasma tikus kontrol. Sedangkan hasil densitometri rata-rata dari sampel plasma manusia menunjukkan ekspresi ITIH3 pada kelompok kanker 1,9 kali lebih tinggi dari kelompok kontrol normal. Uji 2-sampel t test telah dilakukan dan memperlihatkan nilai p<0,001 yang menunjukkan bahwa tingkat ekspresi ITIH3 dapat digunakan untuk membedakan kanker lambung dari kontrol normal. Sebagai biomarker deteksi dini kanker lambung, dilakukan pula analisis western blot pada sampel plasma 36 pasien kanker lambung stadium awal dan 48 pasien kanker lambung stadum lanjut. Hasil analisis statistik ANOVA yang dilakukan menunjukkan perbedaan tingkat ekspresi signifikan (p<0,001) antara orang normal dan pasien kanker lambung stadium awal.

Hasil imunohistokimia pada 19 pasang jaringan kanker lambung dan kanker normal menunjukkan 42 % dari kasus (8/19) tidak teradapat perbedaan tingkat ekspresi ITIH3, 21 % (4/19) menunjukkan ekspresi ITIH3 lebih tinggi pada kanker lambung, dan 26% (5/19) menunjukkan ekspresi ITIH3 lebih rendah pada kanker lambung. Hasil tersebut menunjukkan perbedaan yang tidak signifikan (p=0,236) antara ekspresi ITIH3 dan beberapa histologi kanker lambung. Imunohistokimia juga dilakukan pada 19 sel lines kanker lambung dan hasil yang diperoleh sel MKN45 menunjukkan ekspresi ITIH3 paling banyak yaitu 1,5 kali lipat. Data IHC menunjukkan secara tersirat bahwa up-regulation ITIH3 dalam plasma tidak dapat disamakan dengan hasil up-regulation ITIH3 pada sel-sel kanker. Sebaliknya, data tersebut mendukung gagasan bahwa peningkatan ekspresi ITIH3 di plasma merupakan hasil respon dari pasien kanker lambung. Lebih lanjut hasil penelitian ini menunjukkan bahwa substrat plasma lebih baik dari jaringan untuk mengetahui profil ITIH3 selama diagnostik pemeriksaan.

Hasil penelitian ini menunjukkan sensitivitas yang tinggi dari ITIH3 yaitu 90-96% serta spesifitas sebesar 47-66%. Hasil yang paling menarik adalah potensi ITIH3 untuk mendeteksi dini kanker lambung. Sehingga ekspresi ITIH3 dapat dijadikan biomarker untuk kanker lambung.

Original article :

Poh Kuan Chong, Huiyin Lee, Jianbiao Zhou, Shaw-Cheng Liu, Marie Chiew Shia Loh, Ting Ting Wang, Siew Pang Chan, Duane T. Smoot, Hassan Ashktorab, Jimmy Bok Yan So, Khong Hee Lim, Khay Guan Yeoh, and Yoon Pin Lim, 2010, ITIH3 Is a Potential Biomarker for Early Detection of Gastric Cancer, Journal of Proteome Research 9, 3671–3679